Dirofilaria immitis est un nématode parasite d'importance en santé vétérinaire. Il est l'agent causal de la dirofilariose, une infection pulmonaire potentiellement mortelle des canidés et des félins. La chimioprophylaxie est à base de lactone macrocyclique anthelminthiques (LM), notamment l’ivermectine autorisée depuis 1987 pour éviter l’infection. Les LM sont de puissants antiparasitaires à large spectre qui ciblent les canaux chlore glutamate-dépendants (GluCl) spécifiques aux invertébrés. Les LM se lient de manière pseudo-irréversible aux GluCl ouvrant le canal, ce qui provoque une hyperpolarisation et une paralysie du système neuromusculaire, altérant des processus vitaux des vers comme l'alimentation, la locomotion et les réponses sensorielles. Malheureusement, l'utilisation continue des LM a conduit au développement d'une chimiorésistance. L’existence des isolats de D. immitis résistants aux LM phénotypiquement et génotypiquement distincts des populations sensibles, met en péril l’efficacité des traitements de la dirofilariose.
L’objectif de la thèse était d’étudier les mécanismes et de rechercher les marqueurs moléculaires de la résistance aux LM chez D. immitis. Dans un premier temps, j’ai développé un test enzymatique in vitro basé sur la notion que les LM en paralysant le muscle des pores excréteurs des microfilaires (mf) inhibent la sécrétion d'enzymes, de métabolites et de molécules immunomodulatrices. J’ai montré que l’enzyme triosephoshate isomérase (TPI) est moins excrétée chez le mf résistantes aux LM. Ensuite, j’ai étudié l’impact de la résistance sur la P-glycoprotéine-11 (DimPgp-11), en détaillant les polymorphismes génétiques, l’expression constitutive, et en montrant pour la première fois la localisation stratégique du transporteur sur les pores sécréteurs/excréteurs chez les mfs. Finalement, j’ai identifié un nouveau gène associé à la résistance aux LM codant pour la kynureninase (DimKYNU-1), une enzyme du catabolisme de tryptophane. J’ai confirmé le polymorphisme génétique et l’augmentation d’expression constitutive de DimKYNU-1et l’impact de la résistance sur son produit en aval l’acide 3-hydroxyanthranilique (A3H). Ce travail nous permettra de mieux comprendre l’origine de la résistance au LM et d’identifier de nouvelles cibles pour le développement futur de produits anthelminthiques. La thèse offre une nouvelle perspective sur les implications phénotypiques et génotypiques du développement de la résistance multigénique à les LM chez D. immitis. |
Dirofilaria immitis is a parasitic filarial nematode of veterinary importance. It is the causative agent of dirofilariosis, a potentially fatal pulmonary infection of canids and felines. Dirofilariosis can be prevented with macrocyclic lactone (ML) chemoprophylaxis. The MLs are potent anti-parasiticides which target the invertebrate specific glutamate gated chloride channels (GluCls). The MLs bind pseudo-irreversibly to the GluCls opening the pore leading to hyperpolarization and paralysis of the neuromuscular system, impacting alimentation, locomotion, and mediation of sensory input and response. The MLs are a class of generally safe drugs and have been used as dirofilariosis chemoprophylaxis since the mid 1980s. Unfortunately, the continuous use of ML-based chemoprophylactics over the last four decades has led to the development of drug resistance. These ML-resistant D. immitis isolates are phenotypically and genotypically distinct from the wildtype susceptible populations.
The aim of the thesis was to characterize potential mechanisms and molecular markers of ML resistance in D. immitis. For the first objective I developed of an in vitro colorimetric enzymatic activity assay based on the concept that MLs act on the microfilariae (mf) by paralyzing the excretory pore muscle, inhibiting the release of enzymes, metabolites, and immunomodulatory molecules. I demonstrated that the secretion of the metabolic enzyme triosephosphate isomerase (TPI) via the excretory-secretory (ESP) was unaffected by ivermectin (IVM) exposure in ML-resistant isolates. For the second objective I characterized D. immitis P-glycoprotein 11 (DimPgp-11), a gene strongly linked to the ML-resistant phenotype. I provided an extensive study on its genetic polymorphism, constitutive expression, and demonstrated, for the first time, that DimPgp-11 is strategically located surrounding the ESP in the mf lifestage. Lastly, I assessed the tryptophan catabolism enzyme, kynureninase (DimKYNU-1), a gene with newly identified genetic changes associated with ML resistance. I validated the genetic polymorphism and measured its potential impact of the constitutive expression of DimKYNU-1 and its downstream product 3-hydroxyanthranilic acid (3HA). Ultimately, the thesis provides a novel perspective on the phenotypic and genotypic implications of the development of multigenic ML resistance in D. immitis for the possible future development of anti-filarial pharmaceuticals. |