Les mécanismes épigénétiques contribuent à réguler l’expression des gènes sans en changer leur séquence, en influençant la structure de la chromatine. De plus en plus d’études montrent que les agents pathogènes ont développé des stratégies de virulence pour interférer avec les mécanismes épigénétiques de l’hôte. Bien décrits chez les modèles animaux, de tels mécanismes d’intérférence sur l’épigénome de cellules hôtes végétales demeurent encore méconnus, et plus particulièrement en réponse à des bactéries. Ralstonia solanacearum est la bactérie responsable du flétrissement bactérien, qui affecte plus de 250 espèces végétales dont des grandes cultures et des plantes modèles comme Arabidopis thaliana. En tant que facteur de virulence majeur de R. solanacearum, PopP2 est une acetyltransférase de la famille YopJ qui atténue la résistance basale d’Arabidopsis en ciblant des facteurs de transcription WRKY. Pour mieux comprendre les fonctions de virulence de PopP2, des interacteurs ont été recherchés par une approche double hybride. Les protéines GTE9 et GTE11 de la famille GTE (General Transcription factor, group E) ont ainsi été identifiées. Ces protéines possèdent un bromodomaine connu pour interagir avec des résidus lysine acétylés, notamment présents chez des histones, suggérant que ces protéines pourraient être impliquées dans des processus épigénétiques. Précédemment, des travaux réalisés dans l’équipe ont révélé que GTE9 et GTE11 (i) co-localisent et interagissent avec PopP2 dans le noyau de cellules végétales, et (ii) sont acétylées par PopP2. De plus, GTE9 et GTE11 interagissent in planta avec l’Histone H4 via leur bromodomaine, suggérant que ce sont des lecteurs épigénétiques ciblés par PopP2. Dans ce contexte, les principaux objectifs de ma thèse furent de mieux comprendre la fonction de GTE9 et GTE11 en essayant de déterminer la façon dont PopP2 pourrait les manipuler et si ces protéines jouent un rôle dans la réponse d’A. thaliana vis-à-vis de R. solanacearum. Des analyses de spectrométrie de masse nous ont permis de cartographier les résidus lysine de GTE9 et GTE11 modifiés par PopP2. Plusieurs de ces résidus sont conservés entre les deux protéines et situés autour de leur bromodomaine. Par une approche de FRET-FLIM semi-quantitatif in vivo, nous avons montré que l’interaction GTE9-H4 est altérée par l’activité acetyltransferase de PopP2 suggérant que l’acétylation de GTE9 par PopP2 le dissocie de la chromatine. En sus de GTE9 et GTE11, PopP2 acétyle plusieurs autres protéines GTE. Concernant le rôle de GTE9 et GTE11 dans la réponse de la plante à R. solanacearum, des lignées d’A. thaliana sur-exprimant GTE9 et GTE11 sont plus sensibles à R. solanacearum et cela dépend de l’activité enzymatique de PopP2. Collectivement, nos données indiquent que GTE9 et GTE11 s’apparentent à des lecteurs épigénétiques qui sont ciblés par une bactérie phytopathogène à l’aide d’une acétyltransférase de la famille YopJ. Les GTEs pourraient être des cibles clefs de virulence car nous avons également identifié PopP1, une autre acetyltransferase YopJ de R. solanacearum, comme interagissant aussi avec certaines GTEs. Il reste à déterminer comment le ciblage des protéines GTEs par PopP2 facilite l’infection chez Arabidopsis par R. solanacearum. Pour répondre à cette question, une approche ChIP-seq visant à identifier les régions chromatiniennes ciblées par GTE9 et GTE11 a été initiée (approche en cours de réalisation). En parallèle, nous voulions identifier les sites de la chromatine visités par PopP2 chez Arabidopsis. Pour cela, une seconde analyse ChIP-seq a été entreprise en générant divers outils moléculaires, incluant des versions étiquetées de PopP2 délivrées in planta via un système de sécrétion de type III bactérien. De façon générale, ce projet de thèse permet de progresser sur la compréhension d’une stratégie de virulence développée par une bactérie phytopathogène qui manipule des composantes épigénétiques pour favoriser l’infection. |
Epigenetic mechanisms contribute to the regulation of gene expression without changing its sequence by influencing the chromatin structure. Increasing evidence reveal that pathogens display virulence strategies that can interfere with host epigenetic mechanisms. This is particularly well described in animal pathogens but less in plant pathogens. Especially, very few evidence relate such virulence strategies used by plant pathogenic bacteria. Ralstonia solanacearum is the causal agent of the bacterial wilt disease, which can affect more than 250 plant species including major crops and model plants such as Arabidopsis thaliana. As a potent R. solanacearum virulence factor, PopP2 is an acetyltransferase from the YopJ family that dampens basal immune responses by targeting defensive WRKY transcription factors. In order to better understand the virulence activities of PopP2, we searched for PopP2-interacting proteins using a yeast two hybrid assay, and identified the GTE9 and GTE11 proteins from the GTE family (General Transcription factor, group E). GTE proteins possess a bromodomain, a specific protein module allowing interaction with acetylated lysine residues, notably on histones tails suggesting that they could be involved in epigenetic-related processes. GTE9 and GTE11 were previously shown to (i) co-localise and interact with PopP2 in the plant nucleus, and (ii) to be acetylated by PopP2. Also, GTE9 and GTE11 were shown to interact in planta with Histone H4 through their bromodomain, suggesting that they function as epigenetic readers whose manipulation by PopP2 would promote R. solanacearum virulence. In this context, the main objectives of my PhD were to better understand the the function of GTE9 and GTE11, by trying to determine how they can be manipulated by PopP2 and whether these proteins play a role in the plant response to R. solanacearum. Mass-spectrometry-based analysis enabled us to map the lysine residues modified by PopP2 in GTE9 and GTE11. Several of these residues are conserved between the two proteins and localised on either side of their bromodomain. By semi-quantitative FRET-FLIM assay performed in vivo, we demonstrated that GTE9 interaction with Histone H4 is altered by PopP2 acetyltransferase activity suggesting that PopP2 uses acetylation to dissociate GTE9 from chromatin. In addition to GTE9 and GTE11, PopP2 acetylates several other GTE members. Regarding the role of GTE9 and GTE11 in the plant response to R. solanacearum, GTE9 and GTE11 over-expressing lines displayed an enhanced disease response to R. solanacearum that depended on PopP2 enzymatic activity. Overall, these data indicate that GTE9 and GTE11 behave as epigenetic readers that are manipulated by a plant bacterial pathogen through their targeting by a YopJ family acetyltransferase. GTE proteins could represent key virulence targets for R. solanacearum since PopP1, an additional YopJ family acetyltransferase that belongs to its effector repertoire, also interacts with several of these proteins. How the targeting of GTE proteins is mechanistically impacting the overall course of R. solanacearum infection remains elusive. To answer this question, we undertook a ChIP-seq analysis aimed at identifying the chromatin regions targeted by GTE9 and GTE11 (approach in progress). In addition to this approach, we wanted to identify more globally the chromatin sites visited by PopP2 in Arabidopsis. For this, we have initiated a second ChIP-seq analysis using various molecular tools including tagged versions of PopP2 for in planta delivery through a bacterial type III secretion system. Overall, this PhD work allows to progress on the understanding of a virulence strategy used by a plant bacterial pathogen that consist in manipulating host epigenetic components to promote infection. |